Organinių molekulių ar medžiagų fosforilinimo lygis nustatomas dviem metodais: Western blot ir masių spektrometrija. Fosforilinimas dažniausiai reiškia fosfato prijungimą prie baltymo. Kai fosfatai prisijungia prie baltymų, sutrinka natūralūs procesai ir baltymų fermentų funkcijos žmogaus organizme. Fosforilinimo lygio nustatymas yra labai svarbus gydant įvairias ligas, nuo vėžio iki diabeto.
Western blot yra populiarus metodas, naudojamas tam tikro baltymų rinkinio fosforilinimo lygiui nustatyti. Paprastai naudojami antikūnai, tokie kaip anti-fosfotirozino monokloniniai antikūnai, nes jie lengvai jungiasi su baltymo tirozino liekanomis, kurios yra paveiktos fosforilinimo. Atliekant Western blot metodą, baltymai pirmiausia atskiriami pagal dydį, naudojant elektrinio krūvio metodą, žinomą kaip gelio elektroforezė.
Tada baltymai perkeliami į membraną, padengtą specialiais antikūnais, kurie jungiasi prie baltymų fosfatų. Kai baltymai bus perkelti, antikūnai prilips prie bet kokių baltymų su prijungtu fosfatu. Tada fosforilinimo lygį galima nustatyti membranos rentgeno spinduliais. Bet kokie paveikti baltymai skleis šviesos blyksnį, todėl tyrėjui bus lengviau išmatuoti fosforilinimo lygį.
Masių spektrometrija yra dar vienas būdas išmatuoti medžiagos fosforilinimo lygį. Šis procesas baltymų molekules paverčia jonais, todėl jas lengviau sekti ir išmatuoti. Mėginys jonizuojamas didelės galios jonų šaltiniu, kuris užpildo mėginį elektronais. Šis veiksmas paverčia mėginį katijonais, teigiamai įkrautais jonais.
Masės spektrometro masės analizatorius atskiria jonus pagal jų masę ir krūvio intensyvumą. Tai leidžia tyrėjui atrasti masės ir krūvio santykį, kuris yra labai svarbus nustatant mėginio fosforilinimo lygį. Galiausiai detektorius matuoja jonus taip, kad duomenys būtų rodomi diagramos pavidalu. Diagramoje parodytas jonų masės ir krūvio santykis x ašyje ir santykinis jonų intensyvumas y ašyje.
Fosforilinimo lygiai taip pat gali būti matuojami substrato fosforilinimo metu. Substrato fosforilinimas yra procesas, kurio metu glikolizės metu susidaro adenozino trifosfatas (ATP), molekulė, labai svarbi energijos perdavimui tarp ląstelių. Šis procesas vyksta tiek gyvūnų, tiek augalų ląstelėse.
Augalų ląstelėse ATP molekulės sukuriamos naudojant saulės energiją. Ši energija skatina fosforilinimą augalo chloroplastuose, augalų fotosintezės vietoje. Fosforilinimo lygis koreliuoja su fosfato kiekiu, reikalingu papildomoms ATP molekulėms sukurti.