Aleksandras Flemingas, škotų bakteriologas Londone, per klaidą atrado peniciliną, kai 1928 m. bandė tirti Staphylococcus bakterijas. Jis atliko eksperimentus su bakterijomis savo laboratorijoje Londono Šv. Marijos ligoninėje ir šalia pastatė laboratorinį indą su bakterijomis. atviras langas. Grįžęs prie eksperimento, jis pastebėjo, kad pro atvirą langą ant indo užteršė bakterijas.
Užuot išmetęs savo sugadintą eksperimentą, Flemingas atidžiai pažvelgė į jį po savo mikroskopu. Keista, kad jis pamatė ne tik ant bakterijų augantį pelėsį, bet ir aiškią zoną aplink pelėsį. Penicillium pelėsis, penicilino pirmtakas, ištirpdė mirtinas Staphylococcus bakterijas.
Flemingas iš pradžių buvo optimistiškai nusiteikęs, kad penicilinas bus naudingas kaip antibakterinė medžiaga, nes jis yra saugus žmogaus organizmui, tačiau yra stiprus. Vėliau, 1931 m., jis persigalvojo ir nusprendė, kad žmonėms tai neišsilaikys tiek, kiek reikia kenksmingoms bakterijoms naikinti, ir nustojo tyrinėti. 1934 m. jis pradėjo dar keletą metų trukusius klinikinius tyrimus ir bandė surasti ką nors kitą, kuris jį išgrynintų.
Oksfordo universiteto (Anglija) mokslininkai, įskaitant Howardą Florey, Ernst Chainą ir Normaną Heatley, eksperimentavo su Flemingo atradimu. Jie įrodė, kad penicilinas būtų ir nekenksmingas, ir veiksmingas pelėms, tačiau dar neturi tokio kiekio, kurio reikia žmonėms gydyti. Orvanas Hessas ir Johnas Bumsteadas buvo pirmieji žmonės, kurie jį panaudojo sėkmingai gydydami pacientą.
Antrajame pasauliniame kare penicilinas išgelbėjo daugelio karių gyvybes, tačiau tiekimas buvo itin ribotas, o vaistas greitai pasišalino iš organizmo, todėl ligonius tekdavo dozuoti dažnai. Šiuo metu buvo įprasta išsaugoti gydomų pacientų šlapimą, kad peniciliną būtų galima išskirti ir pakartotinai panaudoti. Galiausiai buvo nustatyta, kad kitas agentas, probenecidas, prailgina penicilino trukmę žmogaus organizme.
Flemingas, Florey ir Chain 1945 metais buvo apdovanoti Nobelio medicinos premija už penicilino atradimą ir sukūrimą. Florey buvo atvirai susirūpinęs dėl galimo gyventojų sprogimo dėl sveikatos priežiūros tobulinimo ir teigė, kad jo darbas su antibiotikais buvo labiau įdomi mokslinė problema, o ne būdas padėti žmonėms. Jis pripažino, kad tai, kad tai gali padėti žmonėms, buvo geras dalykas, bet ne tai, kodėl jis iš pradžių susidomėjo.
Andrew J. Moyeris vėliau atrado, kaip pagaminti didelius penicilino kiekius, patentavo šį procesą ir pažengė į priekį kovojant su infekcinėmis ligomis. 1987 m. jis buvo įtrauktas į Nacionalinę išradėjų šlovės muziejų dėl didelio penicilino kūrimo proceso.