Agarozės gelis yra medžiaga, kuri naudojama biochemijoje ir biotechnologijoje gelio elektroforezei ir dydžio išskyrimo chromatografijai, tai yra didelių molekulių rūšiavimo pagal jų dydį ir elektros krūvį metodai. Šie procesai naudoja agarozę baltymams ir DNR atskirti ir analizuoti. Šioms reikmėms jis labai tinka dėl savo molekulinės struktūros, leidžiančios skirtingo dydžio molekulėms judėti per ją skirtingu greičiu. Medžiaga gaunama iš įvairių rūšių jūros dumblių ir dažniausiai randama laboratorijose miltelių pavidalo. Tam, kad būtų sukurta tam tikram tyrimui tinkama terpė, milteliai įberiami į atitinkamos koncentracijos vandenį, užvirinami ir leidžiama atvėsti iki gelio.
Gamyba
Agarozė išgaunama agaro pavidalu iš kelių rūšių raudonųjų jūros dumblių arba jūros dumblių, aptinkamų Kalifornijoje ir Rytų Azijoje. Agaras, terminas, kilęs iš malajiečių kalbos žodžio agar-agar, reiškiančio želė, paprastai gaunamas iš Gelidium rūšių jūros dumblių. Jį sudaro dvi skirtingos medžiagos, žinomos kaip agarozė ir agaropektinas, ir palaiko jūrinių dumblių ląstelių sieneles. Pašalintas agaras gali būti naudojamas kaip maisto tirštiklis, panašiai kaip želatina, arba kaip vidurius laisvinanti priemonė. Išvalytas, jis gali būti naudojamas kaip terpė bakterijoms, grybeliams ar kitiems mikroorganizmams auginti.
Gana lengva agarozę atskirti nuo agaropektino, nes agarozės molekulės stipriai jungiasi viena su kita, o agaropektinas silpnai želia. Yra keletas būdų, kaip pasiekti agarozę. Vienu būdu į agarą dedama karagenino, kitos raudonųjų jūros dumblių molekulės ir druskos. Dėl to agaropektinas nusėda arba susidaro kieta medžiaga, kurią galima pašalinti iš agaro tirpalo. Kitas metodas prideda fermento pektinazės – cheminės medžiagos, kuri skaido agaropektiną, leidžiantį jam ištirpti vandenyje.
Gelio elektroforezė
Agarozės gelis dažniausiai siejamas su elektroforeze. Atlikdami šią procedūrą, mokslininkai taiko elektrinį lauką per medžiagos plokštę, kurioje yra ištirpusios DNR, RNR arba baltymų fragmentai. Dėl to šios didelės molekulės juda dėl savo elektros krūvių: teigiamai įkrautos rūšys judės į neigiamą pusę ir atvirkščiai. DNR ir RNR fragmentai turi neigiamą krūvį, todėl judės link teigiamo galo, o baltymų fragmentai gali būti neigiami arba teigiami.
Molekulių judėjimo greitis priklauso nuo jų dydžio ir nuo to, kiek jos turi krūvį. Agarozės gelio struktūra yra tokia, kad susidaro tam tikras tinklelis su skylutėmis, pro kurias gali keliauti kitos molekulės. Mažesniems lengviau pralįsti pro skyles, todėl jie greičiau keliauja. Tarp didesnių molekulių vaidmenį taip pat vaidina forma, nes kompaktiškesnės molekulės lengviau praeina. Ši technika naudojama tiek mėginiams analizuoti, tiek tam tikroms DNR sekoms išskirti, kad būtų galima naudoti biotechnologijose.
Prieš elektroforezę DNR mėginys buvo apdorojamas specialiais fermentais, kurie tam tikrose vietose pjauna ilgas, į grandinę panašias molekules, sudarydami mažesnius fragmentus. Agarozės gelis paruošiamas ištirpinant miltelius buferiniame tirpale, kuris yra atsparus pH pokyčiams – rūgštingumui/šarmumui –, kurie kitu atveju galėtų atsirasti dėl elektrocheminio poveikio. Skirtingiems molekulių diapazonams naudojami skirtingi miltelių kiekiai, tačiau paprastai jų koncentracija yra nuo 0.7 iki 1.2%. Šiuo metu paprastai pridedamas fluorescencinis dažiklis, vadinamas etidžio bromidu, nes jis nudažo DNR ir lengvai matomas ultravioletinėje šviesoje. Tada šis mišinys kaitinamas mikrobangų krosnelėje ir leidžiama sustingti.
DNR mėginiai dedami į mažas gelio šulinėles, o per ją tiekiama tiesioginė elektros srovė. Skirtingų dydžių molekulės keliauja per gelį skirtingu greičiu, todėl po tam tikro laiko jos atsiras skirtingose padėtyse, o mažesni fragmentai bus toliau link teigiamo galo. Tai leidžia mokslininkams nustatyti fragmentų dydžius ir išskirti skirtingas DNR sekas.
Kiti naudojimo būdai
Agarozės gelis kartais naudojamas susijusioje technikoje, kuri nenaudoja elektros energijos, vadinama dydžio išskyrimo chromatografija. Taikant šį metodą, stiklinė kolonėlė supilama iš gelio pagamintų rutuliukų ir pilamas tirpalas, kuriame yra skirtingo dydžio molekulės. Priešingai nei elektroforezės atveju, didesnės molekulės greičiau juda kolona žemyn ir atsiranda apačioje. mažesnių sulėtėja karoliukai. Taip yra todėl, kad mažos molekulės yra linkusios absorbuotis į gelio poras, o didesnės yra per didelės, kad patektų į šias poras, ir yra linkusios tekėti tarp granulių. Gelio tipą ir koncentraciją galima reguliuoti, kad atitiktų atskiriamos molekulės dydžius.