Kas yra RNR amplifikacija?

RNR amplifikacija yra procesas, kurio metu paimamos kelios ribonukleino rūgšties (RNR) dalies kopijos ir sukuriami tūkstančiai identiškos sudėties kopijų. RNR gabalai yra makromolekulės, sudarytos iš nukleotidų eilučių, todėl amplifikacija yra kelių etapų procesas, apimantis tikslios nukleotidų sekos atkūrimą iš RNR gabalo. RNR amplifikacija naudinga atliekant tyrimus su virusais, kurių genetinė medžiaga gali būti saugoma kaip atminties RNR (mRNR), o ne DNR; genų ekspresijos organizmuose tyrimas; ir baltymų kūrimas iš transkripcijos RNR (tRNR). Norint amplifikuoti RNR, sukuriama ir amplifikuojama papildoma seka, kuri vėliau naudojama kaip šablonas RNR kopijoms kurti. DNR tarpininkas reikalingas RNR amplifikacijai, nes RNR paprastai būna tik vienos grandinės, nesuporuotos formos, todėl turi būti sukurtas DNR šablonas, kad RNR transkriptazės fermentas veiktų; RNR negali būti perrašyta iš savęs.

Prieš pradedant RNR amplifikaciją, dominanti RNR seka pirmiausia turi būti išskirta iš užterštos medžiagos. Tai padarius, fermentas atvirkštinė transkriptazė pridedama prie RNR šablono. Atvirkštinė transkriptazė naudojama sukurti ląstelių DNR (cDNR) bazių porų seką, papildančią pradinę mRNR. Tada ši pirmoji kDNR grandinė gali būti panaudota kuriant antrąsias kDNR grandines, kurios gali būti naudojamos polimerazės grandininėje reakcijoje – procese, kuris amplifikuoja DNR grandines per pasikartojančius DNR replikacijos ciklus ir vėliau atskiriant dvi grandines. Paprastai cDNR viename DNR sekos gale yra pradmenų arba fermentų, kurie tarnauja kaip signalai jungiantis nukleotidus, taigi, gaminant mRNR grandines, kurios yra identiškos pradinei sekai.

Egzistuoja keli RNR amplifikacijos metodai, tačiau metodas, kuriuo gaunamas didžiausias originaliai kopijai tinkamas mRNR kiekis, vadinamas šablono perjungimo metodu. Šis metodas naudoja atvirkštinės transkriptazės fermentą iš Moloney pelių leukemijos viruso, kuris prideda pradmenų sritį prie pirmosios cDNR grandinės galo, sukūręs šią grandinę iš RNR šablono. Ši pradmenų sritis taip pat pridedama prie antrosios kDNR grandinės, iš kurios daromos amplifikuotos RNR kopijos. Kitas fermentas, vadinamas promotoriumi, gali būti prijungtas prie pradmenų srities antroje cDNR grandinėje, o tai drastiškai padidina RNR kopijų, pagamintų iš šios cDNR grandinės per transkripciją, kiekį.