Kas yra RNR kiekybinis nustatymas?

Ribonukleino rūgšties (RNR) kiekybinis nustatymas yra priemonė, leidžianti nustatyti vidutinę RNR koncentraciją tirpale. Šį nustatymą galima atlikti naudojant įvairias procedūras, kurios paprastai skirstomos į vieną iš dviejų kategorijų: spektrofotometrija arba fluorescencinių dažų kiekybinis nustatymas. Spektrofotometrija remiasi RNR gebėjimu sugerti tam tikrus ultravioletinės šviesos bangos ilgius. Kai kurie fluorescenciniai dažai, tokie kaip etidžio bromidas, gali prisijungti prie nukleino rūgščių, tokių kaip RNR, ir fluorescuoja, kai prisijungia, todėl galima išmatuoti šviesumą.

Kai RNR yra veikiama ultravioletinių spindulių, ji selektyviai sugers šią šviesą esant 260 nanometrų (nm) ir 280 nm bangų ilgiams. Šis metodas atliekamas spektrofotometru, kuris sukuria ultravioletinės šviesos bangos ilgius ir matuoja šviesą, praeinančią per RNR. Didesnė RNR koncentracija sugers daugiau šviesos.

Šių dviejų bangos ilgių derinys dažnai naudojamas RNR kiekybiniam nustatymui, nes šis metodas leidžia tyrėjams sužinoti, ar mėginys yra užterštas kitomis makromolekulėmis, tokiomis kaip baltymai. Šie teršalai dažnai selektyviai sugers 280 nm šviesą, bet ne 260 nm šviesą. Dėl to apskaičiavus sugertos šviesos santykį abiejuose bangos ilgiuose galima nustatyti užterštumo laipsnį.

RNR kiekybinis nustatymas naudojant fluorescencinius dažus duoda rezultatus, kurie yra mažiau jautrūs kai kuriems teršalams ir gali būti naudojami esant mažam RNR kiekiui, dėl kurio spektrofotometrija būtų neįmanoma. Dažikliai, tokie kaip etidžio bromidas, prisijungs prie RNR, o gautą šviesumą galima išmatuoti tiesiogiai naudojant fluorescencinius fotometrus. Jei fotometro nėra, galima paruošti tirpalus su žinomos koncentracijos RNR, o nežinomo mėginio šviesumą galima apytiksliai palyginti su šiais. Ryšys tarp šviesumo ir RNR koncentracijos yra tiesinis, todėl mokslininkai gali greitai nustatyti koncentracijos matavimą pagal šviesumą.

RNR kiekybinis nustatymas naudojant bet kurį metodą gali būti labai jautrus skirtingiems teršalams. Dėl baltymų, fenolio ir didelių dalelių spektrofotometrijos rezultatai gali būti netikslūs. Šie teršalai neturi įtakos fluorescencinių dažų RNR kiekybiniam nustatymui, tačiau šis metodas gali būti netikslus dėl dezoksiribonukleino rūgšties (DNR) buvimo mėginyje.

Dažai, kurie jungiasi su nukleino rūgštimis, jungs ir DNR, ir RNR, o jų šviesumas bus panašus, todėl svarbu užtikrinti švarų RNR mėginį. Įprastas būdas tai padaryti yra į mišrų mėginį prieš pridedant dažų įdedant fermento, kuris naikina DNR, pvz., DNRazę. Priklausomai nuo RNR koncentracijos mėginyje ir esamų teršalų, laboratorijos gali naudoti bet kurį iš šių metodų, kad nustatytų RNR.