Spektrofotometras yra vienas iš mokslinių instrumentų, dažniausiai sutinkamų daugelyje tyrimų ir pramonės laboratorijų. Spektrofotometrai naudojami tyrimams fizikos, molekulinės biologijos, chemijos ir biochemijos laboratorijose. Paprastai pavadinimas reiškia ultravioletinių spindulių (UV-Vis) spektroskopiją.
Šviesos energija priklauso nuo jos bangos ilgio, paprastai vadinamo lambda. Nors elektromagnetinis spektras apima didžiulį bangų ilgių diapazoną, dauguma laboratorijų gali išmatuoti tik nedidelę jų dalį. UV-Vis spektroskopija matuoja nuo 200 iki 400 nanometrų (nm) UV šviesos matavimams ir iki maždaug 750 nm matomame spektre.
UV-Vis spektroskopijos atveju mėginiai paprastai laikomi ir matuojami mažose talpyklose, vadinamose kiuvetėmis. Jie gali būti plastikiniai, jei naudojami matomajame spektre, bet turi būti kvarcas arba lydytas silicio dioksidas, jei naudojami UV matavimams. Yra keletas mašinų, kuriose galima naudoti stiklinius mėgintuvėlius.
Regimoji spektroskopija dažnai naudojama pramonėje kolorimetrijai. Taikant šį metodą, mėginiai matuojami esant keliems bangos ilgiams nuo 400 iki 700 nm, o jų absorbcijos profiliai lyginami su standartu. Šią techniką dažnai naudoja tekstilės ir rašalo gamintojai. Kiti komerciniai UV-Vis spektroskopijos vartotojai yra teismo medicinos laboratorijos ir spausdintuvai.
Atliekant biologinius ir cheminius tyrimus, tirpalai dažnai kiekybiškai įvertinami matuojant jų šviesos sugerties laipsnį esant tam tikram bangos ilgiui. Junginio koncentracijai apskaičiuoti naudojama vertė, vadinama ekstinkcijos koeficientu. Pavyzdžiui, molekulinės biologijos laboratorijos naudoja spektrofotometrus DNR arba RNR mėginių koncentracijai matuoti. Kartais jie turi pažangų įrenginį, vadinamą NanoDrop™ spektrofotometru, kuris naudoja dalį mėginio kiekio, palyginti su tuo, kuris naudojamas tradiciniuose spektrofotometruose.
Kad kiekybinis įvertinimas būtų teisingas, mėginys turi atitikti Beer-Lambert įstatymą. Tam reikia, kad absorbcija būtų tiesiogiai proporcinga kiuvetės kelio ilgiui ir junginio absorbcijai. Yra daugelio, bet ne visų, junginių ekstinkcijos koeficientų lentelės.
Daugelis cheminių ir fermentinių reakcijų laikui bėgant keičia spalvą, o spektrofotometrai yra labai naudingi matuojant šiuos pokyčius. Pavyzdžiui, polifenoloksidazės fermentai, dėl kurių vaisiai paruduoja, oksiduoja fenolio junginių tirpalus, pakeičiant skaidrius tirpalus į matomai spalvotus. Tokias reakcijas galima ištirti matuojant absorbcijos padidėjimą pasikeitus spalvai. Idealiu atveju pokyčio greitis bus linijinis ir pagal šiuos duomenis galima apskaičiuoti normas. Pažangesnis spektrofotometras turės temperatūros kontroliuojamą kiuvetės laikiklį, kad reakcijos būtų vykdomos tikslioje fermentui idealioje temperatūroje.
Mikrobiologinės ir molekulinės biologijos laboratorijos dažnai naudoja spektrofotometrą bakterijų kultūrų augimui matuoti. DNR klonavimo eksperimentai dažnai atliekami su bakterijomis, o mokslininkai turi išmatuoti kultūros augimo stadiją, kad žinotų, kada atlikti tam tikras procedūras. Spektrofotometru jie matuoja absorbciją, kuri yra žinoma kaip optinis tankis (OD). Iš OD galima pasakyti, ar bakterijos aktyviai dalijasi, ar pradeda mirti.
Spektrofotometrai naudoja šviesos šaltinį, kad per monochromatorių peršviečia daugybę bangų ilgių. Tada šis prietaisas perduoda siaurą šviesos juostą, o spektrofotometras lygina šviesos intensyvumą, praeinantį per mėginį, su šviesos intensyvumu, praeinančiu per etaloninį junginį. Pavyzdžiui, jei junginys ištirpinamas etanolyje, nuoroda būtų etanolis. Rezultatas rodomas kaip skirtumo tarp jų absorbcijos laipsnis. Tai rodo bandinio junginio absorbciją.
Šios absorbcijos priežastis yra ta, kad tiek ultravioletinė, tiek matoma šviesa turi pakankamai energijos, kad sužadintų chemines medžiagas iki didesnio energijos lygio. Dėl šio sužadinimo gaunamas didesnis bangos ilgis, kuris matomas, kai sugertis nubraižyta atsižvelgiant į bangos ilgį. Skirtingos molekulės arba neorganiniai junginiai sugeria energiją skirtingais bangos ilgiais. Tie, kurių didžiausia absorbcija matomame diapazone, yra matomi kaip nuspalvinti žmogaus akimis.
Junginių tirpalai gali būti skaidrūs, bet absorbuoti UV diapazone. Tokie junginiai dažniausiai turi dvigubus ryšius arba aromatinius žiedus. Kartais yra viena ar daugiau aptinkamų smailių, kai sugerties laipsnis brėžiamas pagal bangos ilgį. Jei taip, tai gali padėti identifikuoti kai kuriuos junginius, lyginant diagramos formą su žinomų atskaitos brėžinių forma.
Yra dviejų tipų UV-Vis spektrofotometrų mašinos: vieno pluošto ir dvigubo pluošto. Jie skiriasi tuo, kaip matuoja šviesos intensyvumą tarp etaloninio ir tiriamojo mėginio. Dvigubos sijos mašinos matuoja etaloninį ir tiriamąjį junginį vienu metu, o vieno pluošto mašinos matuoja prieš ir po bandomojo junginio pridėjimo.