Western blot protokolas yra tikslūs standartai, pagal kuriuos atliekamas imunoblotas. Western blot yra naudojamas baltymams aptikti audinio mėginyje. Šis procesas atskiria natūralius baltymus, nustatant polipeptidų ilgį naudojant gelio elektroforezę. Tada patys baltymai perkeliami į nitroceliuliozės membraną ir tiriami antikūnais.
Pirmoji Western blot protokolo dalis prasideda audinių surinkimu. Šie mėginiai paimami iš gyvų audinių arba iš ląstelių kultūros. Audinys suskaidomas ir įvedami įvairūs inhibitoriai, tokie kaip proteazė ar fosfatazė, kad fermentai negalėtų virškinti. Ši protokolo dalis paprastai tvarkoma žemoje temperatūroje, kad būtų išsaugoti audiniai.
Gelio elektroforezės procesas yra kitas Western blot protokolo žingsnis. Šioje dalyje baltymai identifikuojami pagal įvairius veiksnius, tokius kaip molekulinė masė arba elektros krūvis. Šis procesas dažniausiai baigiamas naudojant poliakrilamido gelius su natrio dodecilsulfato buferiu. Iš esmės baltymai tampa neigiamai įkrauti ir juda link teigiamai įkrauto elektrodo gelyje.
Baltymų perkėlimas yra kita bendro Western blot proceso dalis. Ant gelio viršaus uždedama membrana, po kurios uždedamas filtravimo popierius. Įvedant elektros srovę, baltymai traukiami į membraną. Tai vadinama faktine analizės „blotingo“ dalimi. Membranos yra labai trapios ir lengvai pažeidžiamos.
Norint užtikrinti teisingą Western blot protokolo eigą, reikia atlikti žingsnį, žinomą kaip įrišimas. Siekiant užkirsti kelią pačių baltymų užteršimui antikūnais, kuriuos reikia pridėti, reikia įgyvendinti tam tikrą apsaugą. Dažniausiai blokuojant naudojamas neriebus sausas pienas ir ploviklis. Tai prisijungia prie atvirų membranos dėmių ir leidžia gauti aiškesnius rezultatus, kai pridedamas antikūnas.
Aptikimas yra kitas žingsnis pagal teisingą protokolą. Baltymai įvedami į antikūnus, kurie buvo susieti su konkrečiu fermentu, kuris suteiks tyrėjams pageidaujamos informacijos. Antikūnas inkubuojamas su membrana 30 minučių ar ilgiau. Po to membrana nuplaunama ir įvedamas antrinis antikūnas, kuris jungiasi su pirmuoju. Dažnai liuminescencinė priemonė padeda mokslininkams identifikuoti.
Medžiaga dar kartą nuplaunama, kad būtų pašalinti nesurišti daiktai. Dažytų juostų dydžio analizė atskleidžia informaciją apie konkretaus baltymo iškilumą ir mastą. Paprastai tai atliekama keletą kartų, kad būtų užtikrinta tinkama analizė. Aptikimo galimybės apima rentgeno spindulius, dažymą ir chemines medžiagas.